Pengaruh Denaturasi dan Inhibitor Terhadap Kinerja Enzim Urease

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENGARUH DENATURASI DAN INHIBITOR TERHADAP KINERJA ENZIM UREASE

KELOMPOK 1 (KELAS E)

RIMBHA PUTRI LESTARI                               201710410311114

AZRUL CHOLIS AZZAHABI                          201710410311131

SHAFELIA NATA AJI KUSUMA                    201710410311156

ARIFA KHARIMATUL FUAD                                     201710410311184

FERDIAN ARIN GARIBALDI                                     201710410311210

PUTRI ANASSTASYA WIDJANARKO                       201610410311125

DOSEN PEMBIMBING:

Dra, Uswatun Chasanah,M.Kes.,Apt

Raditya Weka Nugraheni, M.Farm., Apt

Firasti Agung.N.S., M.Biotech.,Apt

Amaliyah Dina, M.Farm.,Apt

Firdha Anita Yulianti,S.Farm.,Apt

Renny Primasari,S.Farm.,Apt

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG

2019

       I.            Judul Praktikum

Pengaruh Denaturasi Dan Inhibitor Terhadap Kinerja Enzim Urease

    II.            Tujuan Praktikum

Memahami pengaruh denaturasi dan keberadaan inhibitor terhadap kinerja enzim urease

 III.            Dasar Teori

Enzim adalah senyawa organik yang tersusun atas protein yang peristiwa metabolisme bertindak sebagai katalisator, artinya zat yang mampu mempercepat reaksi kimia tetapi zat tersebut tidak ikut bereaksi. Menurut Shahib (1992), enzim adalah katalisator yang mempercepat reaksi kimia dalam makhluk hidup atau badan system biological. Lakitan (2001) menyatakan, enzim merupakan salah satu lintasan metabolisme yang dapat mempercepat laju reaksi dan berkemampuan sebagai katalisator, artinya ion-ion dan senyawa organik yang diserap dari dalam tanah oleh tumbuhan. Enzim merupakan katalis yang lebih khas dan lebih kuat dibandingkan dengan ion-ion logam atau senyawa lainnya yang diserap tumbuhan dari tanah (Salisbury, 1995).

Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur. Sistem enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang harmonis diantara sejumlah aktivitas metabolic yang berbeda (Cartono,2004).

Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat tertentu. Kekhasan inilah cirri suatu enzim. Ini sangat berbeda dengan katalis lain (bukan enzim) yang dapat bekerja terhadap berbagai macam reaksi. Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi didalam sel maupun diluar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat dari pada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katlis yang sangat efisien, disamping itu mempunyai derajar kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energy aktivitas suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan energy (energi endorgani) dan ada pula yang menghasilkan energy atau mengeluarkan energy (eksorgonik) ( Poedjadi, 2006).

Dalam mempelajari mengenai enzim, dikenal beberapa istilah diantaranya holoenzim, apoenzim, kofaktor, gugus prostetik, koenzim, dan substrat. Apoenzim adalah suatu enzim yang seluruhnya terdiri dari protein, sedangkan holoenzim adalah enzim yang mengandung gugus protein dan gugus non protein. Gugus yang bukan protein tadi dikenal dengan istilah kofaktor. Pada kofaktor ada yang terikat kuat pada protein dan sukar terurai dalam larutan yang disebut gugus prostetik dan adapula yang tidak terikat kuat pada protein sehingga mudah terurai yang disebut koenzim. Baik gugus prostetik maupun koenzim, keduanya merupakan bagian yang memungkinkan enzim bekerja pada substrat. Substrat merupakan zat-zat yang diubah atau direaksikan oleh enzim (Poedjadi, 2006).

Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak tahan panas yaitu disebut dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan protein adalah bagian yang aktif dan diberi nama gugus prostetik, biasanya berupa logam seperti besi, tembaga , seng atau suatu bahan senyawa organic yang mengandung logam.Apoenzim dan gugus prostetik merupakan suatu kesatuanyang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang apoenzim dan gugus prospetiknya tidak menyatu. Contoh koenzim adalah vitamin atau bagian vitamin (misalnya : vitamin B1, B2, B6, niasin dan biotin)  (Kartasapoetra, 1994).

2.1  Enzim Urease

Enzim urease disebut juga urea amidohidrolases. Enzim urease merupakan enzim yang mengkatalis hidrolisis dari urea menjadi karbon dioksida dan ammonia. Enzim urease juga terdapat pada beberapa jaringan binatang dan pencernaan mikroorganisme. Urea merupakan salah satu sumber nitrogen non-protein (NPN) yang umum digunakan adalah urea. Urea dibuat dengan jalan mereaksikan ammonia dan karbondioksida. Urea merupakan sumber amoniak dari senyawa spesifik, kandungan urea yang tinggi akan dirombak menjadi basa menguap oleh aktivitas bakteri. Tingginya kandungan urea akan membentuk sejumlah besar amoniak yang mempengaruhi kenormalan kandungan total volatile basa.Selama penyimpanan, jumlah amoniak yang terbentuk relatif tidak dipengaruhi oleh suhu (Fardiaz, 1992).

Urease merupakan enzim yang spesifik mengkatalisis reaksi hidrolisis urea sehingga dapat digunakan sebagai biosensor. Dalam pengembangan biosensor urea, urease dapat diimmobilisasi dalam suatu matrik dengan berbagai teknik seperti adsorpsi, entrapment, ikatan kovalen, cross linking, dan enkapsulasi. Barhoumi et al., (2004) mengembangkan biosensor urea dengan mengimmobilisasi urease dalam polimer lateks menggunakan teknik entrapment. Antonia dan Toressi (1999) menggunakan polipirol untuk mengimmobilisasi urease dengan teknik cross linking dan entrapment (Fauziyah, 2012).

Urease adalah sebuah protein yang ditemukan dalam bakteri, kapang, dan beberapa tanaman tingkat tinggi. Karakteristiknya yaitu pH optimum 7,4 suhu optimum 64 celcius dengan spesifikasi enzimatis : urea dan hidroksi urea. Beberapa tanaman memanfaatkan ureases untuk keperluan yang sama. Ureases ditemukan dalam jumlah yang besar pada jack bean, kacang kedelai dan beberapa biji tanaman lainnya. Ureases juga terdapat pada beberapa jaringan binatang dan pencernaan mikroorganisme. Ureases penting dalam sejarah enzimologi sebagai enzim pertama yang dimurnikan dan dikristalakan (Sumner, 1926).

2.2 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain :

a)        pH

            Struktur ion enzim bergantung pada pH lingkungan. Enzim dapat berbentuk ion positif dan ion negative (Zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH akan mempengaruhi efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat. pH yang rendah atau pH  yang tinggi dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim (Poedjiadi, 1994).

b)        Suhu

            Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada suhu optimum. Suhu yang rendah menyebabkan reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu tinggi, reaksi kimia akan berlangsung cepat. Pada enzim, suhu yang tinggi menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Hal  ini menyebabkan bagian aktif enzim terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun akan menurun (Martono, 1993). Enzim dalam tubuh manusia mempunyai suhu optimum sekitar 37° C. Sebagian besar enzim menjadi tidak aktif pada pemanasan sampai ± 60° C, karena terjadi denaturasi. ( Hafiz Soewoto, 2000)

c)         Konsentrasi enzim

Pada suatu konsentrasi substrat tertentu, laju reaksi meningkat secara linier dengan bertambahnya konsentrasi enzim

d)        Konsentrasi substrat

            Pada konsentrasi enzim tetap dan konsentrasi substrat rendah, kompleks enzim-substrat yang terbentuk sedikit (masih banyak enzim bebas/tidak berikatan dengan substrat). Bila konsentrasi substrat diperbesar, maka makin banyak substrat yang bereaksi dengan sisi aktif enzim, sehingga konsentrasi enzim-substrat makin besar dan menyebabkan meningkatnya laju reaksi. Namun pada batas konsentrasi substrat tertentu, semua enzim telah bereaksi dengan substrat (tidak terdapat enzim bebas).  Dalam  kondisi ini, bertambahnya konsentrasi substrat tidak menyebabkan bertambahnya konsentrasi enzim-substrat, sehingga laju reaksinya pun tidak meningkat (Poedjiadi, 1994).

e)    Inhibitor

            Inhibitor adalah beberapa zat kimia yang dapat menghambat kerja enzim, misalnya garam-garam dan logam berat seperti air raksa. Inhibitor dapat dikelompokkan menjadi tiga macam yaitu inhibitor kompetitif, inhibitor non-kompetitif dan inhibitor umpan balik (Poedjiadi, 1994). Inhibisi kompetitif klasik terjadi pada tapak pengikatan-substrat (katalitik). Struktur kimia sebuah inhibitor analog-substrat (I) umumnya menyerupai struktur kimia substrat (S). oleh karena itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara reversible dengan enzim sehingga yang seharusnya membentuk kompleks EnzS, justru membentuk kompleks enzim inhibitor (Enzl). Pada inhibisi nonkompetitif, tidak terdapat persaingan antara S dan I. struktur inhibitor biasanya tidak atau hanya sedikit mirip dengan struktur S dan dapat dianggap berkaitan dengan domain yang berbeda pada enzim. Inhibitor nonkompetitif reversible menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah enzim (Vmaks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak mempengaruhi nilai Km (Murray,2001).

f)     Waktu inkubasi

            Waktu inkubasi yang dibutuhkan enzim untuk bereaksi dengan substrat secara optimum adalah berbeda-beda. Ada beberapa enzim membutuhkan waktu inkubasi yang lama untuk bereaksi dengan substrat.

2.3 Denaturasi Protein

Denaturasi protein adalah proses perubahan struktur lengkap dan karakteristik protein akibat gangguan interaksi sekunder,tersier, dan kuartener. Denaturasi akibat panas menyebabkan molekul-molekul yang menyusun protein bergerak dengan sangat cepat. Sehingga sifat protein yaitu hidrofobik menjadi terbuka. Akibatnya molekul akan bergerak semakin cepat dan memutus ikatan hydrogen didalamnya(Sumardjo,2008).

Proses denaturasi berlangsung tetap dan tidak berubah,suatu protein yang mengalami proses denaturasi akan mengalami perubahan visikator atau berkurangnya kelarutan cairan sehingga mudah mengendap. Senyawa kimia seperti urea dan garam dapat memecah ikatan hydrogen yang menyebabkan denaturasi protein karena dapat memecah interaksi hidrofilik dan meningkatkan daya larut gugus hidrofobik dalam air deterjen atau sabun dapat menyebabkan denaturasi karena senyawa pada deterjen dapat membentuk jembatan antara gugus hidrofilik dengan hidrofobiksehingga terjadi denaturasi.selain deterjen dan sabun, aseton dan alcohol juga dapat menyebabkan denaturasi (Winarno,2008).

 IV.            Prinsip Reaksi Biokimia

Enzi ini menguraikan ureum menjadi ammonium karbonat. Ammonium karbonat, karena sifatnya yang alkalis, dapat dideteksi dengan menggunakan indicator phenolphthalein, yang memiliki rentang pH sebagai berikut :

             

Kerja enzim urease akan mengakibatkan perubahan pH larutan yang dapat dideteksi dengan timbulnya warna tertentu di dalam larutan.

    V.            Prosedur Praktikum

·      Alat

1.      Tabung reaksi

2.      Pipet tetes

3.      Gelas ukur

·      Reagensia

1.      Larutan ureum (S)

2.      Indicator pp

3.      Susu kedelai mentah (E)

4.      Susu kedelai matang

5.      Larutan HgCl₂

    V.            Bagan Alir

 VI.          Hasil Pengamatan

VII.       Pembahasan

            Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui hasil reaksi dari enzim yang digunakan pada berbagai jenis substrat yang berbeda. Enzim yang digunakan dalam praktikum ini adalah enzim urease. Sedangkan substratnya terdiri dari tiga macam substrat (substratnya berupa ureum dengan larutan yang berbeda beda). Indikator yang digunakan pada praktikum ini adalah phenolphthalein 2%. Reaksi positifnya adalah terjadi perubahan warna menjadi warna merah. Pada percobaan ini digunakan 3 tabung reaksi yang masing-masing diberi label A, B, dan C serta diberi perlakuan yang berbeda-beda pada masing-masing tabung.

  Pada tabung A, campuran dengan 5 ml ureum yang telah diencerkan ditambah 1 tetes indikator phenolphtalein dan 1 ml susu kedelai. Hasil larutan dapat menunjukkan warna merah  muda karena enzim menunjukkan reaksi positif yaitu bekerja menguraikan ureum menjadi amonium karbonat yang bersifat basa/alkalis, sehingga apabila diuji dengan indikator phenolphtalein akan menunjukkan warna merah muda yang artinya pH berkisar antara 8,3-10,0 (basa/alkalis).

Pada tabung B, campuran dengan 5 ml ureum yang telah diencerkan ditambah 1 tetes indikator phenolphtalein dan 1 ml susu kedelai yang telah dipanaskan. Hasil larutan setelah didiamkan selama 10 menit berwarna merah muda pudar, karena enzim yang menguraikan ureum menjadi amonium karbonat tidak berfungsi dengan baik, hal ini dikarenakan enzim yang bertindak sebagai mediator telah rusak/denaturasi pada suhu tinggi. Selain itu, terjadinya sedikit perubahan warna menjadi merah muda pudar juga diduga karena pada saat pemanasan enzim tidak dilakukan pengadukan dengan baik sehingga masih terdapat enzim yang belum mengalami kerusakan/denaturasi yang menyebabkan timbulnya reaksi positif walaupun hanya sedikit dan perubahan warnanya tidak sampai seperti pada tabung A

Pada tabung C, campuran dengan 5 ml ureum yang telah diencerkan ditambah 1 tetes indikator phenolphtalein dan 1 ml susu kedelai kemudian ditambahkan 1 tetes larutan sublimat. Hasil larutan setelah didiamkan 10 menit menunjukkan warna putih karena enzim tidak bekerja disebabkan penambahan inhibitor sublimat. Hal ini dikarenakan amonia tidak dapat terbentuk sehingga tidak memberikan perubahan warna ketika diteteskan indikator phenolptalein dan diduga pH tidak berubah secara signifikan pula. Sublimat merupakan logam berat yang dapat menghambat kerja enzim secara irreversibel non-kompetitif. Sublimat tersebut bekerja dengan menggangu sisi kofaktor enzim sehingga enzim tidak teraktivasi dan reaksi gagal berlangsung.

VIII.  Kesimpulan

1.    Enzim urease merubah urea menjadi amonium karbonat dan karbondioksida.

2.    Indikator PP mengindikasi adanya amonium karbonat dengan menunjukkan perubahan dari larutan tak berwarna menjadi larutan berwarna merah (bersifat basa/alkalis).

3.    Enzim urease dapat mengalami kerusakan/denaturasi pada suhu tinggi.

4.    Enzim urease dapat dihambat oleh logam berat salah satunya adalah sublimat.

 IX.  Pertanyaan

1. Tuliskan reaksi hidrolisis ureum menjadi ammonium karbonat yang dikatalasis enzim urease !

Jawab : NH2co + 2H2O  → (NH4)2 co3

2. Apa yang dimaksud dengan denaturasi enzim ? sebutkan faktor-faktor yang dapat menyebabkan denaturasi enzim !

Jawab: Denaturasi enzim adalah proses berubahnya struktur lengkap dan karakteristik bentuk protein ( kerusakan struktur sekunder tersier) tetapi struktur primer berupa ikatan peptida masih utuh. Faktor- faktor yang menyebabkan denaturasi yaitu suhu,pH,tekanan,garam

3. Termasuk kedalam kelompok inhibitor apakah larutan sublimat? Jelaskan mekanismenya dalam menghambat kinerja enzim !

Jawab : Larutan sublimat termasuk dalam inhibitor non kompetitif irreversible. Mekanismenya yaitu sublimat mengikat gugus sulfihidrat,

Daftar Pustaka

Anna Poedjiadi, (1994), Dasar-dasar Biokimia, UI Press, Jakarta.

Cartono, M.Pd. 2004. Biologi Umum. Bandung: PRISMA PRESS

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Bogor: Institut Pertanian Bogor

Fauziyah, Begum. 2012. “Optimasi parameter analitik biosensor urea berbasis immobilisasi urease dalam membran polianlin” Jurnal Kimia Volume 1 (1) Hal.66, September 2012

Girindra, Aisjah. 1986. Biokimia 1. Jakarta: Erlangga

Kartasapoetra,a.g, 1994. Teknologi Penanganan Pasca Panen. Jakarta: Rineka Cipta

Lakitan, B. 2001. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: Raja Grafindo Persada

Murray, R. K., 2001, Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran  EGC, Jakarta.

Murray, R.K., Granner, D.K. dan Rodwell, V.W., 2009, Biokimia Harper, Edisi 27, Ahli Bahasa Braham U. Pendit, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Salisbury, F.B. dan Ross, C.W., 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 2. Bandung: Institut Teknologi Bandung Press

Shahib, M.N. 1992. Pemahaman Seluk Beluk Biokimia dan Penerapan Enzim. Bandung: PT. Citra Aditya Bakti

Soewoto, Hafiz, dkk.2000.Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta: Widya Medika.

Stoker, H.S., 2007, General, Organic, and Biological Chemistry, Fourth Edition, Houghton Mifflin Company, Boston.

Wirahadikusumah, m. 1989. Biokimia   Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung: Institut Teknologi Bandung